馬鈴薯莖尖超低溫冷凍脫毒方法一般按照選擇材料、切取莖尖、預培養(yǎng)、預處理、超低溫冷凍、解凍、恢復培養(yǎng)、脫毒效果檢測、組織培養(yǎng)擴繁這幾個步驟來獲得再生植株，經過病毒檢測后，無毒植株用于生產脫毒馬鈴薯種薯(圖2)。液氮罐

 

1. 選擇材料

馬鈴薯不同部位的組織經過超低溫冷凍處理后細胞的存活力有明顯差異。一般細胞體積小細胞質較濃、液泡少的分生組織細胞會比液泡大的成熟的分化細胞再生能力強、成苗率也高。研究發(fā)現(xiàn)選擇馬鈴薯莖尖分生組織作為處理對象，可以提高成苗率，有利于獲得脫毒苗。

2. 預培養(yǎng)材料

材料通過預培養(yǎng)使得細胞適度脫水，減少細胞內自由水含量，可以提高細胞的抗冷凍能力，從而提高成活率。目前*常用的預培養(yǎng)方式是在培養(yǎng)基中添加一些使細胞脫水的保護性物質，可以選用蔗糖、二甲基亞砜、甘露醇等。在高濃度保護性物質處理之前選用0~5℃的低溫馴化，可以明顯提高成活率。馬鈴薯莖尖可以切取2~3mm大小，然后放在0.3mol·L-1高蔗糖濃度的預培養(yǎng)基中預培養(yǎng)一天，光照16h，光照強度2000lx。高濃度的蔗糖可增加培養(yǎng)基的滲透壓，使得馬鈴薯莖尖組織的細胞脫水，從而減少細胞內自由水的含量。

3. 保護劑處理

常用的抗冷凍保護劑是能夠穿透細胞膜的化合物DMSO和各種糖類物質，通過促進細胞膜對水分的通透性，降低細胞內水分冰點溫度，避免胞內外冰晶形成，保護細胞內的核酸、蛋白質等生物大分子物質。保護劑的選擇是超低溫處理成功的關鍵因素，好的保護劑應該滿足對細胞毒性小、易溶于水、解凍后容易從細胞中清洗掉等要求。目前常用Sakai于1990年創(chuàng)立的按照一定配方合成的多種保護劑復合液，被稱為植物材料玻璃化溶液(plant vitrification solution，PVS)。將預培養(yǎng)一天后的馬鈴薯莖尖加載到PVS2溶液中，其中PVS2液的成分為：MS+30%(W/V)甘油+15%(W/V)乙二醇+15%(W/V)二甲基亞砜(DMSO)+0.4mol·L-1蔗糖。具體方法是用移液管吸取15μL的PVS2溶液加在0.03mm厚的1.0cm×4.0cm的鋁箔上，然后將預培養(yǎng)后的馬鈴薯莖尖裝載到PVS2液滴中，室溫25℃下處理20min，成活率可達90%。

4.液氮冷凍處理

將包裹有馬鈴薯莖尖的鋁箔在液氮中蘸一下，然后把鋁箔條放入1.5mL離心管中，再將離心管置于液氮中超低溫處理1h。

5. 解凍洗滌

對超低溫處理后的材料需要馬上進行解凍，常用的解凍方法有兩種：一是快速解凍法，適合于大多數(shù)材料，具體做法是將液氮中冷凍1小時后的材料放于25~40℃的水浴鍋中進行解凍1~3min完全融化后取出材料，避免水浴溫度對細胞的熱傷害以及保護劑對細胞的毒害作用。另一種是慢速解凍法，適用于經過低溫馴化或者經過脫水處理的材料，把液氮處理1h后的材料在0℃下慢速解凍30min左右。解凍后的材料一般都需要立刻洗滌，為了除去細胞內含的高濃度保護劑，避免對恢復培養(yǎng)的影響。*常用的洗滌方法是室溫下用含1~2mol·L-1蔗糖濃度的培養(yǎng)基洗滌10min左右。在無菌超凈工作臺中，將液氮處理1h后的包裹馬鈴薯莖尖鋁箔條從離心管中取出，然后迅速放入加有1.2mol·L-1蔗糖濃度的液體MS培養(yǎng)基中洗滌2~3次，每次10min。液氮罐

6. 恢復培養(yǎng)

經過洗滌后的材料需要立即轉移到恢復培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)。研究發(fā)現(xiàn)將材料先培養(yǎng)在黑暗或弱光下一段時間后，再在正常光照下有利于形成再生植株。

將洗滌后的馬鈴薯莖尖在無菌超凈工作臺中取出，用無菌紙吸去殘留在材料表面的洗滌培養(yǎng)基，接種到固體恢復培養(yǎng)基(MS+0.1mg·L-1NAA+0.5mg·L-16-BA+1.0mg·L-1GA3)上進行培養(yǎng)。培養(yǎng)條件選擇先黑暗培養(yǎng)7d，再在弱光1000lx下培養(yǎng)7d，然后正常光照2000lx培養(yǎng)。當分化出根芽后轉移到MS培養(yǎng)基上，1個月就可獲得完整植株，統(tǒng)計成活率。

7. 病毒檢測

對再生馬鈴薯試管苗用酶聯(lián)免疫法進行病毒檢測，只有不帶病毒的組培苗才可以進行組織培養(yǎng)擴繁，用于生產無毒馬鈴薯種薯。液氮罐